“病原体2019-ncov可能是一种新型乙型冠状病毒。”
文章来自《新英格兰医学杂志》2月20日刊登的论文。
摘要
2019年12月，中国武汉出现与海鲜批发市场相关的不明原因肺炎的聚集性病例。对肺炎患者样本进行全基因组测序后发现了一种从未见过的乙型冠状病毒属（betacoronavirus）病毒。该病毒从感染者气道上皮细胞中分离出，随后被命名为2019-ncov，它属于正冠状病毒亚科（orthocoronavirinae subfamily）的sarbe冠状病毒亚属（subgenus sarbecovirus），但形成了另外一簇的进化分支。2019-ncov与mers-cov和sars-cov都不同，它成为可以感染人类的冠状病毒科中的第7个成员。对该病毒的加强监控和进一步的研究正在进行中（由中国国家重点研发项目和国家传染病防治重大专项资助）。
新出现和再度出现的病原体对全球公共卫生提出挑战。冠状病毒是一种有包膜的rna病毒，广泛存在于人类、哺乳动物和鸟类宿主中，可以导致呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。目前已知6个冠状病毒属可对人类致病，其中以229e、oc43、nl63和hku1为主，可以导致免疫功能正常的宿主发生普通感冒症状；另外两种病毒，严重急性呼吸综合征冠状病毒（sars-cov）和中东呼吸综合征病毒（mers-cov），引起人畜共患传染病，有时可发生致死性疾病。sars-cov是中国广东2002—2003年间暴发的严重急性呼吸综合征的病原体，而mers-cov是2012年中东地区爆发的严重呼吸道疾病的病原体。鉴于冠状病毒的高流行率和广泛分布，其基因组的巨大遗传多样性和频繁重组，以及人-动物间接触活动的增加，新型冠状病毒可能因频繁的跨物种感染和偶尔的动物传人事件而周期性地出现在人类面前。
2019年12月末，武汉几家卫生机构报道了不明原因肺炎的聚集性病例，这些病例在流行病学上与武汉一家海鲜和生鲜批发市场相关。12月31日，中国疾病预防控制中心（中国cdc）派出快速反应小组，和湖北省和武汉市卫生机构一起进行了流行病学和病原学调查。我们在疫情早期报道了这项调查的结果，确定了肺炎聚集性病例的来源，并描述了中国cdc在肺炎患者中检出的一种新型冠状病毒，并且描述了其中2例患者的肺炎临床特征。
方法
病毒诊断方法
4份下呼吸道样本（包括支气管肺泡灌洗液）采集自2019年12月21日或之后在武汉发现的不明原因肺炎患者，这些患者在临床表现出现前不久曾去过华南海鲜市场。7份支气管肺泡灌洗液样本采集自北京各医院的不明原因肺炎患者，用作对照样本。我们按照制造商（罗氏）说明的方法，使用高纯度病毒核酸提取试剂盒（high pure viral nucleic acid kit）从临床样本（包括作为阴性对照的未受感染的培养物）中提取核酸。并且按照制造商的说明，使用respifindersmart22kit（pathofinder bv）和lightcycler 480实时pcr系统，利用聚合酶链反应（pcr）检验提取的核酸样本是否有病毒和细菌核酸。我们按照补充附录中详细描述的方法分析了样本是否有22种病原体（18种病毒和4种细菌）。此外，我们采用前文所述的全基因组高通量测序方法发现上述方法无法识别的微生物序列，并按照补充附录中的说明，利用实时反转录pcr（rt-pcr）方法，通过靶定全β-cov的共有rdrp区的方式检测了病毒rna。
病毒分离
采集支气管肺泡灌洗液样本，置于无菌杯中，加入病毒转运培养基。然后离心样本，去除细胞碎片。将上清接种到人气道上皮细胞上，人气道上皮细胞获取自肺癌手术患者的气道样本，经ngs证实无特定病原体。
将人气道上皮细胞在塑料基质上展开，培养产生1代细胞，然后以每孔2.5×105个细胞的密度在可渗透的transwell-col（直径12 mm）支架上接种。在气液界面进而人气道上皮细胞培养4～6周，形成分化良好的极化培养物，类似于体内假复层黏液纤毛上皮。
在感染前，用磷酸盐缓冲盐水冲洗人气道上皮细胞顶面3次；将150 μl支气管肺泡灌洗液样本上清接种到细胞培养物顶面。在37℃孵育2小时后，使用500 μl磷酸盐缓冲盐水冲洗10分钟，去除未结合的病毒；在37℃，5%二氧化碳条件下将人气道上皮细胞在气液界面保存。每48小时向人气道上皮细胞顶面添加150 μl磷酸盐缓冲盐水，并且在37℃孵育10分钟后采集样本。将假复层黏液纤毛上皮细胞在这一环境中保存；在1∶3稀释瓶装原液中传代顶面样本，产生新细胞。每天利用光学显微镜监测细胞是否有细胞病变效应，并利用rt-pcr监测上清中是否有病毒核酸。传代3次后，制备顶面样本和人气道上皮细胞，用于透射电子显微镜检查。
透射电子显微镜检查
收集表现出细胞病变效应的人气道上皮细胞培养物上清，使用2%多聚甲醛灭活至少2小时，并超速离心，将病毒颗粒沉淀。将富集后的上清在涂膜网格上进行负染，用于检查。收集表现出细胞病变效应的人气道上皮细胞，使用2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定，然后使用1%四氧化锇固定，梯度酒精脱水，pon812树脂包埋。将树脂块切片（80 nm），分别用醋酸铀和柠檬酸铅染色。在透射电子显微镜下对阴染的网格和超薄切片进行观察。
病毒基因组测序
将从支气管肺泡灌洗液和培养物上提取的rna作为模板，对基因组进行克隆和测序。我们结合使用illumina测序和nanopore测序方法来测定病毒基因组，使用clc genomics软件4.6.1版（clc bio）将序列读长组装到重叠群图谱（contig maps，一组重叠的dna片段）中。随后设计特异性引物进行pcr，并利用5'-或3'-race（cdna末端快速扩增）填补常规桑格测序的基因组空缺区域。从凝胶中纯化这些pcr产物，并按照制造商的说明，使用bigdye terminator v3.1循环测序试剂盒和3130xl基因分析仪进行测序。
利用muscle对2019-ncov和参考序列进行多序列比对。利用raxml（13）进行全基因组的系统发育分析，共进行了1,000次自展复制，并建立了一个通用的时间可逆模型作为核苷酸替代模型。
结果
患者
2019年12月27日，3例成人患者因重度肺炎就诊，并被收入武汉一家医院。患者1为49岁女性；患者2为61岁男性；患者3为32岁男性。我们收集了患者1和患者2的病史：患者1自诉无慢性基础病史，但从2019年12月23日开始出现发热（体温37～38℃）、咳嗽及胸部不适症状。发病后4日，咳嗽和肺部不适症状加重，但发热症状缓解；我们基于计算机断层（ct）扫描结果做出了肺炎诊断。此患者的职业为海鲜批发市场的零售商贩。患者2自诉从2019年12月20日开始出现初始症状发热和咳嗽，发病后7日出现呼吸困难且后续2日进行性加重（胸片见图1），在此期间开始机械通气。该患者曾经常出入海鲜批发市场。患者1和患者3在经治疗后康复并于2020年1月16日出院，但患者2于2020年1月9日死亡，没有采集到患者的活检样本。
新型冠状病毒的检测和分离
2019年12月30日，我们从武汉金银潭医院采集了这3例患者的肺泡灌洗液。用respifindersmart-22试剂盒对这些临床样本进行了常规检测，但未发现特异性病原体（包括hcov-229e、hcov-nl63、hcov-oc43和hcov-hku1）。将从支气管肺泡灌洗液提取的rna作为模板，对基因组进行克隆，并结合使用illumina测序和nanopore测序方法进行测序。从单个样本中获得了超过20,000个病毒序列读长，大多数重叠群与乙型冠状病毒属的b谱系匹配，与之前发表的蝙蝠sars-样冠状病毒（bat-sl-covzc45, mg772933.1）基因组达到85%的一致性。我们对泛乙型冠状病毒属共有rdrp区的rna进行了实时rt-pcr检测，也得到了阳性的结果（尽管检测样本的循环阈值高于34）。临床样本的病毒分离采用人气道上皮细胞及vero e6和huh-7细胞系，分离出的病毒被命名为2019-ncov。
为了明确2019-ncov感染的人气道上皮细胞内可否观察到病毒颗粒，我们每日对模拟感染和2019-ncov感染的人气道上皮细胞培养物进行光学显微镜检查，并且培养6日后进行透射电子显微镜检查。在人气道上皮细胞表面接种96小时后可观察到细胞病变效应。通过光学显微镜观察，在视野中央（图2）未见细胞纤毛运动。但采用vero e6和huh-7细胞系培养6日后未观察到特异性细胞病变效应。
负染法电镜下观察2019-ncov颗粒一般呈球形，但有些呈多形性（图3）。直径在60～140 nm。病毒颗粒有明显的棘突，9～12 nm，导致病毒颗粒呈现日冕状。在人气道上皮超薄切片中观察到胞外游离病毒颗粒，以及胞质膜囊内充满病毒颗粒的包涵体。观察到的这一形态与冠状病毒科相符。
为了进一步确定病毒特征，我们采用illumina和nanopore测序方法对从患者临床样本（支气管肺泡灌洗液）和人气道上皮细胞分离出的2019-ncov进行了基因组从头测序。我们在全部3例患者体内均检出新型冠状病毒。我们从支气管肺泡灌洗液中获得了2个接近全长的冠状病毒序列（betacov/wuhan/ivdc-hb-04/2020，betacov/wuhan/ivdc-hb-05/2020|epi_isl_402121），从1例患者体内分离出的病毒获得了全长病毒序列（betacov/wuhan/ivdc-hb-01/2020|epi_isl_402119）。这3个新型冠状病毒的全基因组序列已经上报给gasaid网站（betacov/wuhan/ivdc-hb-01/2019，登录id：epi_isl_402119；betacov/wuhan/ivdc-hb-04/2020，登录id：epi_isl_402120；betacov/wuhan/ivdc-hb-05/2019，登录id：epi_isl_402121），且核苷酸序列与之前发表的蝙蝠sars样冠状病毒（bat-sl-covzc45, mg772933.1）基因组达到86.9%的一致性。这3个2019-ncov基因组汇总形成了sarbe冠状病毒亚属中的独立分支，显示了典型的乙型冠状病毒属结构：一个5′非翻译区（utr）、复制酶复合体（orf1ab）、s基因、e基因、m基因、n基因、3′utr和几个未识别的非结构开放读码框。
尽管2019-ncov与在蝙蝠体内检出的一些乙型冠状病毒相似（图4），但与sars-cov和 mers-cov却有明显不同。这3份来自武汉的2019-ncov冠状病毒与2份来自蝙蝠体内的sars样病毒株zc45和zxc21形成了一个新的分支；来自人体的sars-cov毒株则与在中国西南部蝙蝠体内分离出的sars样冠状病毒共同形成了sarbe冠状病毒亚属的另外一个分支。2019-ncov和乙型冠状病毒属其他成员在保守复制酶区域（orf 1ab）未达到90%的序列一致性，因此武汉病毒性肺炎的可能病原体2019-ncov是一种新型乙型冠状病毒，属于冠状病毒科的sarbe冠状病毒亚属。
讨论
我们报告了2019年12月和2020年1月在中国武汉住院患者中发现的一种新型冠状病毒（2019-ncov）。该病毒存在的证据包括通过全基因组测序、直接pcr和培养方法在3例患者的支气管肺泡灌洗液中均鉴定出此病毒。这种可能由冠状病毒引起的疾病被命名为“新型冠状病毒感染肺炎”（ncip），完整的基因组已提交给gasaid网站。系统发育分析显示，2019-ncov属于乙型冠状病毒属；乙型冠状病毒属包括在人、蝙蝠和其他野生动物中发现的冠状病毒（（sars-cov、蝙蝠sars样冠状病毒等）。我们报告了对此病毒的分离，并初步描述了其特异性细胞病变效应和形态学。
多年来，分子技术已被成功运用于鉴定感染源，全基因组高通量测序是发现病原体的有力工具。二代测序和生物信息学正在改变我们应对传染病暴发的方式，增进了我们对疾病发生和传播的理解、加速了病原体的鉴别并促进了数据的共享。我们在本文中描述了利用分子技术和全基因组测序发现的一种新型冠状病毒，它可能是导致中国武汉3例重度肺炎的元凶。
虽然建立人气道上皮细胞培养方法是费时费力的工作，但它是分析人呼吸道病原体的重要研究工具。我们的研究表明，先在人气道上皮细胞培养物上增殖呼吸道分泌物，再用透射电镜和全基因测序方法分析培养上清物，成功地观察和检测到了新的人冠状病毒，这可能是传统方法无法做到的。
我们还需要进一步建立可准确、快速鉴别呼吸道未知病原体的方法。基于在此研究中得到的3条完整基因组，我们针对2019-ncov基因组中的orf1ab、n和e区域设计了几种特异且灵敏的检测方法，用于检测临床样本中的病毒rna。引物集和标准操作程序已与世界卫生组织共享，用于在全球和中国监测和检测2019-ncov感染。最新的数据显示，中国已有830人中检出2019-ncov。
虽然本研究没有完全遵循科赫法则，但我们的分析提供了武汉爆发2019-ncov的证据。我们还需提供有关2019-ncov引起武汉疫情的其他证据，包括通过免疫组化方法在患者肺组织中检出2019-ncov抗原，在两个时间点从同一患者的血清样本中检出可证实血清转化的抗病毒igm和igg抗体，以及来自动物（猴子）实验的致病性证据。至关重要的是进行流行病学调查，以确定感染的传播方式、繁殖间隔期和感染的临床症状谱，从而指导我们制定预防、控制和制止2019-ncov传播的策略。
（摘自中国疾病预防控制中心国家疾病预防控制中心病毒疾病预防控制所nhc生物安全重点实验室（nz，ww，js，xz，bh，rl，pn，xm，dw，wx，gw，gfg，wt ），以及首都医科大学附属北京地坛医院传染病科；武汉市金银潭医院（d.z.），湖北省疾病预防控制中心病毒病检测科和中国科学院（w.t.）生物安全大科学中心以及山东第一医科大学和山东医学科学院。）



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